После окончания университета Николай Васильевич работал ординатором, а затем заведующим хирургическим отделением Одесской городской больницы.

В 1863-м он защитил диссертацию, потом стажировался в клиниках Германии, Франции, Англии, познакомился с передовыми хирургическими направлениями стран Европы, а в 1870-м получил приглашение преподавать в Киевском университете. Позже врачу предложили вести курс хирургической патологии в военно-медицинском вузе Петербурга и заведовать клиническим отделением местного армейского госпиталя. В 1880 году профессору поручили возглавить кафедру хирургической клиники при Московском университете. Через два года его перевели на должность декана медицинского факультета в этом же учебном заведении, а в 1893-м назначили директором Института усовершенствования врачей.

Николай Склифосовский принимал участие в кампаниях в период Франко-прусской, Русско-турецкой, Балканской войн: сначала трудился на перевязочных пунктах и полевым доктором, затем консультантом и ведущим хирургом Русской императорской армии.

Ученый провел анализ разных видов переломов и огнестрельных ран, внедрил принципы антисептического лечения, впервые в мире применил местную анестезию, был одним из пионеров в области полостной хирургии, разработал оригинальную операцию соединения костей при ложных суставах. Николай Васильевич внес большой вклад в отечественную стоматологию, челюстно-лицевую хирургию, являлся учредителем Общества русских врачей, а также организатором Пироговских съездов. Благодаря его участию открылись курсы для акушерок, на которых женщины смогли получать высшее медицинское образование.

Склифосовский – автор 114 научных работ, отражающих передовые идеи, соредактор журнала «Хирургическая летопись» и основатель «Летописи русской хирургии».